Mine sisu juurde

ATAC-seq

Allikas: Vikipeedia

ATAC-seq (ingl Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) on molekulaarbioloogia meetod, mis tuvastab kromatiini ĂŒlegenoomset ligipÀÀsetavust. Meetodit kirjeldati esmakordselt aastal 2013.[1]

EesmÀrk

[muuda | muuda lÀhteteksti]

Kromatiin on DNA ja sellega seonduvate valkude kompleks. DNA pakkimine kromatiiniks on vajalik, et see rakutuuma Àra mahuks. Kromatiin vÔib olla avatud (eukromatiin) vÔi suletud (heterokromatiin) seisus. Heterokromatiinis on DNA tihedalt pakitud, mistÔttu on see inaktiivne. Eukromatiinis on aga DNA lÔdvemalt pakitud - see on ligipÀÀsetav erinevatele transkriptsioonifaktorile (TF), mis saavad lÀbi viia transkriptsiooni.

ATAC-seqi meetod on mĂ”eldud transkriptsiooniliselt aktiivse ehk avatud kromatiini tuvastamiseks. Selleks kasutatakse muteeritud Tn5 transposaasi, mis ĂŒheaegselt nii fragmenteerib kui ka mĂ€rgistab vastavad piirkonnad adapteritega.[1] Tavalistel transposaasidel on loomult madal aktiivsus, ATAC-seqis kasutatakse muteeritud hĂŒperaktiivset Tn5 varianti.[2] ATAC-seqi puhul ei ole vaja sonikeerimise ega ka fenool-kloroformi eraldamise etappi (nagu Faire-seqis)[3], kasutada antikehasid (nagu ChIP-seqis)[4] vĂ”i viia lĂ€bi sensitiivset ensĂŒmaatilist seedimist (nagu Mnase-seqis ja Dnase-seqis).[5] Samuti piisab ATAC-seqi katse jaoks ainult 50 000 rakust (ChIP-seqi puhul on vaja vĂ€hemalt 1 miljon rakku). KokkuvĂ”ttes saab ATAC-seqi ettevalmistused valmis vĂ€hem kui kolme tunniga[6], mis teeb antud meetodist kiirema ja odavama alternatiivi, vĂ”rreldes varasematega.

Meetodi kirjeldus

[muuda | muuda lÀhteteksti]

ATAC-seqi katsele eelnevalt on vaja huvipakkuvad rakud eraldada ja loendada. Rakkude loendamine on kriitilise tĂ€htsusega samm, sest sellest oleneb muuhulgas transpositsiooni efektiivsus.[7] Kuigi ATAC-seqi saab teha minimaalselt 500 rakuga, siis kĂ”ige optimaalsem rakkude arv on 50 000.[8] SeejĂ€rel rakud lĂŒĂŒsitakse ning eraldatakse tuumad. Puhastatud kromatiin fragmenteeritakse ja mĂ€rgistatakse adapteritega, kasutades Tn5 transposaasi. JĂ€rgneb puhastusetapp, misjĂ€rel kromatiini fragmendid amplifitseeritakse polĂŒmeraasi ahelreaktsiooni (ingl PCR - polymerase chain reaction) abil ning kasutades triipkoodidega praimereid. Saadud raamatukogu analĂŒĂŒsitakse reaalaja PCRi (qPCR) vĂ”i jĂ€rgmise pĂ”lvkonna sekveneerimise meetoditega (ingl NGS - next generation sequencing).[1][7]

AndmeanalĂŒĂŒs

[muuda | muuda lÀhteteksti]

ATAC-seqi andmete analĂŒĂŒsiks on loodud mitmeid erinevaid töövooge, mille ĂŒhisteks etappideks on joondamise-eelne kvaliteedikontroll, adapterite eemaldamine, jĂ€rjestuste joondamine referentsgenoomile, PCR duplikaatide ja mitokondriaalsete jĂ€rjestuste eemaldamine ning piikide (avatud alade) tuvastamine. Sellele jĂ€rgnevad spetsiifilisemad analĂŒĂŒsid nagu erinevus kromatiini ligipÀÀsetavuses kudedes/rakutĂŒĂŒpides, TF motiivide rikastusanalĂŒĂŒs vĂ”i integreerimine RNA-seqi vĂ”i ChIP-seqi andmetega.[9]

Rakendused

[muuda | muuda lÀhteteksti]

ATAC-seqi on kasutatud, et defineerida kromatiini ĂŒlegenoomset ligipÀÀsetavust erinevates vĂ€hitĂŒĂŒpides.[10] Samuti on leitud, et kollatĂ€hni kĂ€rbumise puhul langeb ĂŒleĂŒldine kromatiini ligipÀÀsetavus.[11] ATAC-seq on nĂ€idanud, et kromatiini olek on vererakkude diferentseerumise ajal vĂ€ga dĂŒnaamiline[12] ning aidanud kaardistada transkriptsioonifaktorite seondumissaite.[13]

Üksikraku ATAC-seq

[muuda | muuda lÀhteteksti]

Originaalprotokolli mugavdamise teel arendati vĂ€lja ĂŒksikraku ATAC-seq. Üksikute rakutuumade eraldamiseks kasutatakse mikrovedelikundust (ingl microfluidics), mistĂ”ttu saab ATAC-seqi reaktsioone lĂ€bi viia individuaalselt.[6] Üksikud rakud saadakse, kas mikrovedelik-seadmete vĂ”i tilga-pĂ”histe meetodite (ingl droplet-based methods) abil.[6][14] Alternatiivselt saab kasutada ka kombinatoorset indekseerimist (ingl combinatorial cellular indexing), mis ei vaja ĂŒksikute rakkude eraldamist. Selle meetodi kĂ€igus mĂ€rgistatakse rakud kordumatute triipkoodidega ning igas jĂ€rgnevas voorus lisatakse uus triipkood, luues sellega iga raku jaoks ainulaadsed triipkoodide kombinatsioonid.[15] Kombinatoorne indekseerimine vĂ”imaldab genereerida ĂŒhe eksperimendi raames 10 000 kuni 100 000 raku epigeneetilise profiili.[16] Eelneva meetodi puuduseks on aga see, et see nĂ”uab suures koguses eritellimusel valmistatud modifitseeritud Tn5 transposaasi.[17] Uuema sci-CAR meetodiga (ingl single-cell combinatorial indexing chromatin accessibility and mRNA) saab samaaegselt analĂŒĂŒsida nii ĂŒksikute rakkude transkriptoomi kui ka epigenoomi.[18]

Puudused

[muuda | muuda lÀhteteksti]

Kuigi ATAC-seq annab hea ĂŒlevaate epigeneetilisest maastikust, ei ole vĂ”imalik sellega kindlaks mÀÀrata tĂ€pset toimemehhanismi (nĂ€iteks millised kromatiini modifikatsioonid vĂ”i transkriptsioonifaktorid huvipakkuvas regioonis esinevad). Tulemuste tĂ€psemaks tĂ”lgendamiseks saab ATAC-seqi korreleerida teiste meetoditega. Lisaks, originaalne ATAC-seqi protokoll on mĂ”eldud rakkude hulgianalĂŒĂŒsiks, mis nĂ€itab kromatiini keskmist ligipÀÀsetavust ĂŒhe proovi kohta. See aga eeldab, et ĂŒhes proovis olevate rakkude omavaheline varieeruvus on vĂ€ike. Heterogeensuse tabamiseks saab kasutada nĂ€iteks ĂŒksikraku ATAC-seqi.[8]

Vaata ka

[muuda | muuda lÀhteteksti]

Viited

[muuda | muuda lÀhteteksti]
  1. 1 2 3 Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ (2013). “Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position”. Nature Methods. 10 (12): 1213–8. doi:10.1038/nmeth.2688
  2. ↑ Reznikoff WS (2008). “Transposon Tn5”. Annu Rev Genet. 42:269-86. doi:10.1146/annurev.genet.42.110807.091656
  3. ↑ Simon JM, Giresi PG, Davis IJ, Lieb JD (2012). “Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA”. Nature Protocols. 7 (2): 256–67. doi:10.1038/nprot.2011.444
  4. ↑ Savic D, Partridge EC, Newberry KM, Smith SB, Meadows SK, Roberts BS, et al. (2015). “CETCh-seq: CRISPR epitope tagging ChIP-seq of DNA-binding proteins”. Genome Research. 25 (10): 1581–9. doi:10.1101/gr.193540.115
  5. ↑ Hoeijmakers WA, Bártfai R (2018). “Characterization of the Nucleosome Landscape by Micrococcal Nuclease-Sequencing (MNase-seq)”. Chromatin Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. Vol. 1689. pp. 83–101. doi:10.1007/978-1-4939-7380-4_8
  6. 1 2 3 Buenrostro JD, Wu B, Litzenburger UM, Ruff D, Gonzales ML, Snyder MP, et al. (2015). “Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation”. Nature. 523 (7561): 486–90. Bibcode:2015Natur.523..486B. doi:10.1038/nature14590
  7. 1 2 Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. (2015). “ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide”. Curr Protoc Mol Biol. 109:21.29.1-21.29.9. doi:10.1002/0471142727.mb2129s109
  8. 1 2 Grandi FC, Modi H, Kampman L jt (2022). “Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq”. Nat Protoc 17, 1518–1552. doi:10.1038/s41596-022-00692-9
  9. ↑ Yan F, Powell DR, Curtis DJ jt (2020). “From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis”. Genome Biol 21, 22. doi:10.1186/s13059-020-1929-3
  10. ↑ Corces MR, Granja JM, Shams S jt (2018). “The chromatin accessibility landscape of primary human cancers”. Science. 26;362(6413):eaav1898. doi:10.1126/science.aav1898
  11. ↑ Wang J, Zibetti C, Shang P jt (2018). “ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration”. Nat Commun. 10;9(1):1364. doi:10.1038/s41467-018-03856-y
  12. ↑ Lara-Astiaso D, Weiner A, Lorenzo-Vivas E jt (2014). “Chromatin state dynamics during blood formation”. Science. 345(6199):943-9. doi:10.1126/science.1256271
  13. ↑ Li Z, Schulz MH, Look T, Begemann M, Zenke M, Costa IG (2019). “Identification of transcription factor binding sites using ATAC-seq”. Genome Biol. 20(1):45. doi:10.1186/s13059-019-1642-2
  14. ↑ Mezger A, Klemm S, Mann I, Brower K, Mir A, Bostick M jt (2018). “High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution”. Nature Communications. 9 (1): 3647. doi:10.1038/s41467-018-05887-x
  15. ↑ Cusanovich DA, Daza R, Adey A jt (2015). “Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing”. Science. 348 (6237): 910–914. doi:10.1126/science.aab1601
  16. ↑ Lareau CA, Duarte, FM, Chew JG jt (2019). “Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility”. Nat Biotechnol 37, 916–924. doi:10.1038/s41587-019-0147-6
  17. ↑ Chen X, Miragaia RJ, Natarajan KN, Teichmann SA (2018). “A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling”. Nature Communications. 9 (1): 5345. doi:10.1038/s41467-018-07771-0
  18. ↑ Cao J, Cusanovich DA., Ramani V jt (2018). “Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells”. Science. 361 (6409): 1380–1385. doi:10.1126/science.aau0730
PĂ€rit lehekĂŒljelt "https://et.wikipedia.org/w/index.php?title=ATAC-seq&oldid=7152153"